iTRAQ標記定量蛋白質組學技術

  iTRAQ技術是由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)2004年開發的同重標簽標記的蛋白相對定量技術。該技術采用4種或8種同位素的標簽,通過特異性標記多肽的氨基基團,然后進行串聯質譜分析,可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量。

技術原理

 iTRAQ標記試劑由三部分組成:報告基團、質量平衡基團和肽反應標記試劑基團,形成4種或8種相對分子質量均等量(145或305)的異位標簽。

                                              

                                                                                        iTRAQ標記試劑結構示意圖

 報告部分:8標質量數分別為113~121Da(無120),4標質量數為114-117Da,因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品(客戶可按需選擇標記個數)。

 肽反應部分:能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發生共價連接,從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上,幾乎可以標記所有蛋白質。

 平衡部分:8標質量數分別為192-184(無185),4標質量數31~24Da,與報告部分相互配合,組成恒定質量數為305或145Da,保證iTRAQ試標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質荷比。

 

                                                         

                                                                                                    iTRAQ實驗流程圖

 iTRAQ試劑是可與氨基(包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基)連接的胺標記同重元素。在一級質譜圖中,任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在一級質譜中,不同來源的相同肽段表現為一個峰;在二級質譜中,iTRAQ試劑中的平衡基團發生中性丟失,信號離子表現為不同質荷比(114~121)的峰,因此根據波峰的高度及面積,可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異;同時,肽段的MS/MS結果結合數據庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類。

技術路線


                                                    

技術優勢


靈敏度高:可檢測出低豐度蛋白;

分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等;

適用范圍廣:可以對任何類型的蛋白質進行鑒定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等;

高通量:可同時對8個樣本進行分析,特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析;

結果可靠:定性與定量同步進行,同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息;

自動化程度高:液質連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。


應用領域

科研: 研究特定疾病發生的遺傳變異,如單基因遺傳病、罕見疾病基因檢測等。

農業: 用于品系鑒定、優勢性狀篩選、群體遺傳學分析、親緣關系分析等

      動植物: 動植物生長發育、抗病、抗逆機制研究以及育種研究。同時可實時更新和補充關聯信息的完整性

醫學: 闡釋疾病的發生發展機制,發現與疾病相關的生物標志物, 以應用于疾病診斷、治療、預后及用藥研究。


平臺介紹

高度可靠的結果,快速

  • HRAM 和全掃描能力可以自始至終捕獲所有樣品數據,從而實現回顧性數據分析而無需再次掃描樣品
  • 分辨率高達 140,000 FWHM,可消除同量異序同分異構化合物的干擾,在分析復雜基質中的樣品時,提高結果可靠性
  • 全掃描和全離子碎片(AIF)模式質量準確度均優于1ppm,可以確保可靠的化合物識別
  • 12Hz 的快速掃描和多路掃描技術特別適合 UHPLC 應用
  • 快速極性切換可以獲得最多信息
  • AIF 和多重解離技術——源內 CID 和 HCD——可以輔助化合物識別
  • 擴展的質量數范圍達到 6,000m/z,可以提高對單電荷小分子和生物分子的檢測能力
  • 超過四個數量級的掃描動態范圍以及飛克級靈敏度,可以在一次掃描中同時檢測痕量級和高豐度化合物

更加可靠地應用于藥物發現和代謝組學研究

  • 和三重四極桿質譜相當的定量能力不僅可用于定量分析母體化合物和代謝物,而且在識別確定化合物同時提供更高通量
  • 快速 HRAM Orbitrap 技術可以消除干擾,實現高可靠性的代謝物結構識別,并可完成大規模代謝組學和脂類組學樣品分析
  • MS 和 MS/MS 模式中均可進行現快速“掃描到掃描”極性切換,可以在單次進樣中完成最多的代謝物檢測和識別

獲得更多蛋白組學信息

  • 與 CID 相比,HCD 可以產生更多碎片和更高質量的 MS/MS 譜圖,提高識別能力
  • 高譜圖質量和寬動態范圍可以對其他儀器無法發現的蛋白質進行識別和定量分析。
  • 定量/定性分析能力使蛋白質組學發現實驗輕松轉換為目標蛋白質定量分析。

高度特異性的環境和食品安全分析

  • 由于該質譜儀的特異性超過三重四極桿 Q-TOF 或 Q-Trap 的水平,使其成為定量/定性篩查平臺的首選
  • 數據依賴的全掃描 MS/MS 能力及 HRAM 數據確保每次識別都具有最高可靠性

為臨床研究和法醫毒理學的定量確證提供高度可靠性

  • SRM 和 HRAM 的結合輕松為內源性類固醇、濫用藥物和鎮痛劑的定量確證分析提供了高度可靠性。

特定應用的軟件可實現更高通量


儀器型號

Thermo Scientific Q Exactive、AB SCIEX Triple TOFTM fusion plus


樣品要求

1.蛋白運輸:24小時內可以4℃運輸;

2.蛋白長期保存:-20℃;

3.待檢測蛋白要求:蛋白量最低300μg,濃度最低要求為1μg/μl,否則同位素無法標記;

4.蛋白提取試劑要求:使用普通的組織、細胞裂解液即可,切忌不要使用二維電泳試劑提取;

      5.直接提供組織或細胞:動物、微生物組織濕重>10mg;植物鮮嫩組織>100mg;細胞量>107個;血液體積>500μl。




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